專家姓名：李玉成
性別：男技術(shù)職稱：高級(jí)工程師
年齡：72- 所在地區(qū)：中國(guó)/廣東
- 【專業(yè)方向】醫(yī)藥、生物、保健品、食品等
- 【技術(shù)服務(wù)】該專家愿意提供以下技術(shù)服務(wù)：醫(yī)藥、生物、保健品、食品、飲料、涂料、肥料、農(nóng)藥、顏料、催干劑、潤(rùn)滑劑、環(huán)保阻燃劑、塑料橡膠助劑、精細(xì)化工項(xiàng)目技術(shù)服務(wù)。
- 專家介紹 研究成果 技術(shù)轉(zhuǎn)讓
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老師您好 我想咨詢下細(xì)菌、大腸桿菌的檢查方法是....？我們公司請(qǐng)的老師教的操作讓人有所質(zhì)疑，所以...拜托老師您了
咨詢者：林孝銘 咨詢時(shí)間：2007-06-13 狀態(tài)：已回復(fù)
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提供參考:飲用水中大腸桿菌快速檢測(cè)方法
【申請(qǐng)(專利)號(hào)】 CN200410022322.2 【專利申請(qǐng)日】 2004-04-14
【公開(kāi)(公告)號(hào)】 CN1563422 【公開(kāi)(公告)日】 2005-01-12
【主分類號(hào)】 C12Q1/68 【分類號(hào)】 C12Q1/68;C12Q1/04
【頒證日】 0000-00-00 【優(yōu)先權(quán)】
【申請(qǐng)(專利權(quán))人】 重慶大學(xué) 【地址】 400045重慶市沙坪壩區(qū)重慶大學(xué)生城市建設(shè)與工程學(xué)院
【發(fā)明(設(shè)計(jì))人】 龍騰銳;馬穎;方振東;周從直 【國(guó)際申請(qǐng)】
【國(guó)際公布】 【進(jìn)入國(guó)家日期】 0000-00-00
【專利代理機(jī)構(gòu)】 重慶華科專利事務(wù)所 【代理人】 康海燕
【摘要】
本發(fā)明涉及一種飲用水大腸桿菌的快速檢測(cè)方法。應(yīng)用分子生物學(xué)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用PCR方法檢測(cè)大腸桿菌，包括以下幾個(gè)步驟：水樣中微生物的收集、微生物基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物觀察。采用上述方法與傳統(tǒng)方法相比，時(shí)間短，從水樣送到實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始到檢測(cè)完畢，大約需要4～5個(gè)小時(shí)；靈敏度高，可以檢測(cè)到1～10個(gè)大腸桿菌/mL水樣。而傳統(tǒng)檢測(cè)方法至少需要48h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1、飲用水中大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：(1)水樣中微生物的收集及其DNA的提�。翰捎脺缇蟮臑V膜或?yàn)V器過(guò)濾水樣，在裝有無(wú)菌水的EP管中，洗滌濾膜，離心，棄上清液，備用；(2)水樣中微生物DNA的提取：A、向EP管中加入TE緩沖液，使之重懸；B、加入SDS和蛋白酶K，混勻，溫育45min～1h；C、加入氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中；D、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中；E、加入異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，離心；F、棄上清，沉淀物用乙醇洗滌，晾干；G、將沉淀重溶于TE緩沖液，搖勻；H、用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的基因組DNA模板的0D值，計(jì)算其DNA濃度，計(jì)算方法為：DNA濃度(μg/μL)＝OD值260nm×樣品稀釋倍數(shù)×50/1000I、將基因組DNA模板做好標(biāo)記，貯存，備用；(3)PCR擴(kuò)增；反應(yīng)引物：上游引物：5’-tgttcagtggcaagagtt-3’下游引物：5’-taatcgatatacccgctc-3’50μL反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5μLTag酶2U/μL1μLMgCl2(25mM)5μLdNTP(2.5MM)5μLddH2029μL上游引物10μM2μL上游引物10μM2μL模板DNA1.5μg/μL1μL(4)產(chǎn)物觀察：A、凝膠的準(zhǔn)備：先配置瓊脂糖溶液，加熱，使其充分溶解，再加入溴化乙錠溶液；B、配置TAE電泳液；C、倒膠：將配置好的瓊脂糖溶液倒入膠板中，待其凝固后，放入電泳槽中；D、電泳：將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物與緩沖液按比例混合，加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，接通電源，設(shè)定電壓和電流，開(kāi)始電泳。E、觀察；將擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外光下觀察，拍攝圖片。
李玉成
回復(fù)：李玉成 回復(fù)時(shí)間：2007-06-17
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